Dinshaw Patel教授受邀做学术报告

2024年11月13日下午，受蛋白质与植物基因研究国家重点实验室肖俊宇教授邀请，纪念斯隆凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，MSKCC）教授Dinshaw Patel在生命科学学院邓祐才报告厅带来了一场题为“Bacterial CRISPR and protective Goddess systems involved in antiphage defense”的精彩报告。

细菌在与噬菌体数十年的军备竞赛中，进化出了一套复杂多样的防御系统。噬菌体侵入细菌后，细菌会产生一系列生化变化，通常以产生第二信使的方式传递噬菌体入侵的信号。第二信使下游的组分在功能上通常由2部分构成，一种是参与识别信号的结构域或蛋白，另一种是发挥效应功能的结构域或蛋白。细菌抗噬菌体系统发挥作用的命运通常有2种，一种是直接破坏噬菌体基因组的结构，另一种是在噬菌体完成繁殖周期前破坏自身细胞结构阻止噬菌体的繁殖，也被称为流产感染。Dinshaw教授介绍了基于环寡核苷酸的抗噬菌体信号系统，糖基化酶Brig家族、Lamassu抗噬菌体系统以及Kiwa抗噬菌体系统中第二信使下游关键的检测器和效应器蛋白的结构，利用生物化学、结构生物学的手段为这些重要过程提供了线索和证据。

Ⅲ型CRISPR-Cas系统在细菌的免疫中发挥着重要的作用，当这一系统结合在靶RNA上后可以发挥三种功能，第一种是激活RNA酶活性对靶RNA进行切割，第二种是跟踪到转录该RNA的DNA上，对单链DNA进行切割，第三种是利用Ⅲ型CRISPR-Cas系统中的Csm亚基，也就是Cas10蛋白，发挥将ATP转化为环状寡核苷酸（c-OA）的功能。随后c-OA发挥第二信使的功能，可以结合并激活其下游的效应蛋白，非特异性单链RNA水解酶Csm6对单链RNA进行切割。此外，c-OA也可以结合带有CARF结构域的若干蛋白，启动基于环寡核苷酸的抗噬菌体信号系统（CBASS），启动细菌的流产感染（abortive infection）。c-OS下游的效应蛋白通常包括一个CARF结构域和另外一个效应结构域，可能发挥着脱氨、水解核酸等功能。Csm6是由结合c-OA的CARF结构域和切割单链RNA的HEPN形成的同源二聚体。在结合环四腺苷酸（cA4）后，随着时间的推移，CARF结构域可能同样发挥水解功能将cA4水解为环磷酸盐ApA>p。水解后的ApA>p并不能起到激活Csm6的RNase的功能。这样的现象表明cA4可能扮演着一种一种计时器的机制。

为了进一步探究CARF结构域与另外的效应结构域之间可能的互作机制，Dinshaw教授对另外四种CARF家族蛋白进行了研究。第一种是Card1蛋白，它的效应结构域是DNase。通过解析apo状态下以及结合cA4的Card1的晶体结构，观察到了核酸酶部位的结构变化，但这种结构变化并不能很好说明Card1结合水解DNA的特异性，反而活化状态下的Card1同样可以水解单链RNA，并且水解速率更快。第二种研究的蛋白是Cam1，它在CARF结构域的N端存在着一个跨膜结构域。全长的Cam1在细胞膜上会形成一个四聚体，实验证明，四条跨膜螺旋在膜上会形成一个离子通道，该通道能够诱导细胞膜去极化抑制细菌的生长（growth arrest）。通过AlphaFold3进行预测比较apo以及结合cA4后的通道，apo状态下的Cam1会存在一组精氨酸伸向孔道中间阻塞孔道，结合cA4之后该孔道会打开。对预测结构通道处的氨基酸进行突变，当将通道处氨基酸突变为碱性氨基酸后会阻塞通道，验证了预测结果的正确性。目前Dinshaw教授正在尝试利用冷冻电镜解析复合体的结构。第三种研究的蛋白是Cad1，它的效应结构域是一种腺苷脱氨酶结构域（ADA）。不同于其它类型的蛋白，Cad1单独的CARF结构域在二聚化后既可以结合cA4，又可以结合cA6。当表达全长蛋白时，会发现Cad1形成六聚体。Apo状态下复合体呈现一个三角形，ADA结构域在内侧，相邻的二聚体之间通过ADA中的一个色氨酸对（W349）相互作用联系在一起。通过生化实验发现，Cad1的底物是ATP而非AMP、dATP等其余形式的腺苷衍生物，催化ATP脱氨变为ITP依赖Mg离子以及靠W349对形成的六聚体。在加入第二信使cA4后，会发现Cad1会出现二聚体、六聚体以及更高寡聚的形式，但只有六聚体有催化活性。Apo状态中的Cad1六聚体看不到ATP的密度，但结合cA4后的Cad1六聚体能看到ATP的密度。cA4的结合并不会引起大范围的结构变化，而是会导致ATP以反式构象结合在口袋中，同时活性中心附近的一个组氨酸会向ATP方向移动，因此导致了脱氨酶的活化。

Dinshaw教授的此次讲座，介绍了细菌抵御噬菌体多样的分子机制，利用结构生物学的手段对这些过程有了更深入的了解。

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