宾夕法尼亚大学艾宇熙博士受邀访问国家重点实验室并做学术交流

2023年9月15日下午来自宾夕法尼亚大学的艾宇熙受邀前来北京大学蛋白质与植物基因研究国家重点实验室进行学术交流，并在生物技术楼301会议室作了题为“CRISPR/Cas13 effectors have differing extents of off-target effects that limit their utility in eukaryotic cells”的学术报告。艾宇熙曾在2015年至2018年期间在顾红雅教授实验室进行本科生科研工作，于2018年在北京大学获得了学士学位，随后在宾夕法尼亚大学攻读博士，计划于2023年11月完成博士论文答辩。她将于2024年1月开始在Memorial Sloan Kettering癌症中心担任研究学者职位，目前的研究兴趣主要在真核mRNA处理的调控。

近年来，以CRISPR-Cas系统为代表的基因编辑技术已经彻底改变了生物学领域，为定义基因功能和开发新的治疗方法提供了许多新机会。许多CRISPR-Cas系统以DNA为靶标（例如常用的Cas9和Cas12系统），但Cas13效应器以RNA为靶标，因此具有在细胞中调控目标RNA水平的潜力。另一方面，环状RNA是许多真核生物蛋白编码基因的产物，细胞将下游5'剪接位点连接到上游3'剪接位点时形成，称为反向剪接。环状RNA的生成通常由内含子重复序列之间的碱基配对促进，这些转录本的表达还受到RNA结合蛋白的组合作用、核心剪接体组分的水平以及外显子跳跃事件的调控。使用RNAi敲低技术研究环状RNA特异性较差，因此使用Cas13对环状RNA进行抑制以研究其生物学功能就成为了艾宇熙感兴趣的研究课题。

在研究中，艾宇熙利用荧光蛋白报告基因的共转染实验来表征每种Cas13效应器的靶向效应和脱靶效应。在实验中，eGFP和mCherry的报告基因质粒以及表达RxCas13d或其他Cas13效应器与引导RNA的质粒在果蝇细胞被共转染。在诱导报告基因的转录后提取总RNA，通过Northern印迹分析检测目标RNA和非目标RNA的表达水平。结果表明，RxCas13d在果蝇细胞中具有显著的脱靶效应，即对非目标RNA的效应与对目标RNA的效应一样强烈。这种脱靶效应可能是由于RxCas13d/引导 RNA复合物识别目标mRNA时触发了细胞内RNA的显著非特异性降解。此外，研究还发现RxCas13d的脱靶效应与目标mRNA的表达水平密切相关，当目标mRNA的表达水平降低时，脱靶效应也相应减弱。

而与RxCas13d相比，PspCas13b在果蝇细胞中表现出更好的特异性，脱靶效应较弱。并且在细胞中同时表达人工设计的易成环和不易成环的外显子-内含子序列以及PspCas13b和对应的引导RNA后，发现在序列相似的情况下，Cas13对环状RNA有着较好的特异性，这也就说明PspCas13b适合作为特异性敲低环状RNA的基因编辑工具。

在此基础上，艾宇熙分别在人类细胞HeLa和HEK293T重复RxCas13d、引导RNA与报告基因质粒的实验。结果表明，RxCas13d在HEK293T细胞中特异性较好，但在HeLa细胞中则特异性较差，这说明Cas13的脱靶效应和细胞类型有很大的关系。

总的来说，艾宇熙的研究发现不同Cas13效应器在各种细胞中具有不同的效率和特异性，RxCas13d具有较差的特异性，容易产生脱靶效应，而PspCas13b在果蝇细胞中表现出更好的特异性，但仍然可能对非靶RNA产生一些效应。Cas13效应器的特异性还受到目标RNA表达水平、成环与否以及表达产物的影响，并且不同的细胞类型可能会影响Cas13效应器的特异性效应，因此在不同细胞类型中使用Cas13效应器时需要谨慎考虑其特异性和脱靶效应。未来的工作将聚焦于Cas家族新成员的功能探究、Cas13在细胞器中的定位研究以及将Cas13与RNase进行串联等等。

本场报告由顾红雅教授主持。报告结束后，艾宇熙与参会师生进行了深入交流，对环状RNA的生物学作用和表达模式以及Cas13在植物研究中的潜在应用进行了探讨。