王忆平课题组在创建稳定高效联合固氮系统方面取得了突破性进展

农业生产向农田施用大量的工业氮肥可提高其产量。但只有30-50%的工业氮肥可被农作物吸收，其余部分造成土壤板结、水体污染及富营养化环境等问题。大量工业氮肥也促进了微生物的活动，产生了更多的氧化亚氮（N2O）。氧化亚氮可致人予心脏病，其在百年尺度内的增温效应是等量二氧化碳的近300倍。因此，工业氮肥的大量施用严重阻碍了现代农业的可持续发展。

生物固氮是自然界中一小部分原核微生物利用体内复杂的固氮酶系统，在常温常压下将大气中的氮气转换为氨的过程。就其与植物的关系而言，自然界存在自生、共生、联合三大固氮体系，其中自生固氮体系包括蓝藻、发菜等原核微生物，它们通常具有光合作用与固氮作用两大能力，其光合作用所产生的生物能在满足其它生物过程的同时，也可满足其生物固氮过程的能量需求，从而具有自我生长的能力；共生固氮系统中的根瘤菌具有很高的宿主特异性，根瘤菌可特异性识别豆科植物，在其根部诱发一种特异性的器官-根瘤，侵染到根瘤细胞中的根瘤菌可发育成类菌体，并进行生物固氮。根瘤菌与豆科植物的共生关系在于：豆科植物通过光合作用为在根瘤细胞中的类菌体提供碳源，作为其生长发育及固氮的能量来源，而发育成类菌体的根瘤菌为豆科植物提供其生长所需要的氮素；联合固氮体系中的联合固氮菌宿主范围广，可通过定殖在包括水稻、玉米、小麦等主要农作物的根际，靠吸收植物根际的上千种分泌物生长及固氮，但其固定的氮素绝大部分都用于自我生长，提供给植物的氮素几乎没有或非常有限。因此，就联合固氮系统而言，如何改造这些定殖在植物根际的联合固氮菌，使其在不影响自我生长的同时分泌更多的氮素，减少农业生产对工业氮肥的依赖，是生物固氮研究领域的重要科学问题。

当前，国际上固氮合成生物学在联合固氮菌上的靶点主要有两个。一个是通过突变，阻断或减弱联合固氮菌中谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）的活性，致使固氮酶所固定的氮素不能被其自身同化利用，从而泌出体外的目的；另外一个是试图通过遗传学改造，阻断联合固氮菌原有信号转导系统对联合固氮菌中固氮酶表达的控制，转而利用植物源信号控制联合固氮菌的固氮活性，为农作物服务。以上两种模式都在某种程度上忽略了联合固氮菌自身的生长状态，为最终对植物的氮素贡献带来潜在隐患。

2023年11月18日，北京大学蛋白质与植物基因研究国家重点实验室王忆平课题组在Nature Communications期刊以Article的形式在线发表题为“Diurnal switches in diazotrophic lifestyle increase nitrogen contribution to cereals”的研究论文，提出了固氮菌双重生活方式的昼夜转换增加对谷物的氮素贡献模型，在创建稳定高效联合固氮系统方面取得了突破性进展。

图：联合固氮菌双重生活方式的昼夜转换增加对谷物的氮素贡献模式图。定殖在植物根际的联合固氮菌通过吸收植物根际分泌物进行生物固氮，通过其温度依赖型谷氨酰胺合成酶介导联合固氮菌双重生活方式的转换。在夜间（23°C条件下），其所固定的氮素与氨同化处于解偶联状态，联合固氮菌通过牺牲自身生长进行生物固氮与泌铵，并将泌出的氮素输送给谷物；在白天（30°C条件下），其所固定的氮素与氨同化处于偶联状态，所固定的氮素为联合固氮菌的生长恢复和细胞增殖提供营养。GS*表示P95L突变的GS。N2ase表示固氮酶。

生物固氮与氨同化的解耦联是构建联合固氮生物工程菌和高效植物联合固氮系统的先决条件。本研究发现对谷氨酰胺合成酶中一个氨基酸残基的突变，使得胞内氮素水平的主导信号分子-谷氨酰胺的合成表现为温度敏感型，最终导致氮调控的基因和酶（包括固氮酶）也表达为温度敏感型，本研究构建的工程固氮大肠杆菌和联合固氮产酸克雷伯氏菌点突变株可在23°C，而不在30°C向胞外分泌mM级的铵。而我国中原地区主要粮食作物生长期的昼夜温度变化就正好在30°C - 23°C这个温度区间。实验结果表明，本研究构建的联合固氮菌点突变株，与传统的“持续供氮模式”（23°C恒温）相比，“间歇供氮模式”-“30°C-23°C”昼夜温差变化可为共培养的真核小球藻，及禾本科农作物玉米提供更多的氮素。为此，本研究提出了一个联合固氮菌双重生活方式的昼夜转换模型，在白天（30℃），联合固氮菌固定的氮素用于自身生长恢复和增殖；在夜间（23℃），联合固氮菌固定的氮素外泌到体外为谷物所吸收，促进谷物的生长（附图）。本研究对维持联合固氮菌株的活力和可持续性氮素的供应有重要的意义，在农业生产中的有很高的潜在应用价值。

北京大学生命科学学院毕业生汤雨倩博士、博士后秦德斌、田哲贤副教授为论文共同第一作者；英国John Innes Centre研究中心Ray Dixon教授与北京大学生命科学学院王忆平教授为论文共同通讯作者；北京大学生命科学学院博士生陈文茜和马原溪、毕业生王吉龙博士、北京大学现代农学院杨建国研究员以及美国印第安纳大学医学院Dalai Yan博士参与了部分研究工作。该研究得到了国家自然科学国际合作重点基金、科技部国家重点研发计划项目、北京大学生科启东创新基金以及蛋白质与植物基因研究国家重点实验室的资助。