孔道春实验室揭示真核细胞维持DNA复制叉稳定的核心机制

2021年6月10日，北京大学生命科学学院、蛋白质与植物基因研究国家重点实验室孔道春实验室在美国科学院期刊PNAS 在线发表了题为“The intra-S phase checkpoint directly regulates replication elongation to preserve the integrity of stalled replisomes”的研究论文（https://www.pnas.org/content/pnas/118/24/e2019183118.full.pdf）。该研究回答了过去50年在checkpoint（细胞周期检验点）调控维持真核细胞DNA复制叉稳定领域的两个核心问题：1）停顿的DNA复制叉为什么会不稳定，并倾向于垮塌；2）checkpoint调控维持停顿复制叉稳定的核心分子机制是什么？

正常细胞生长过程中，基因组不稳定主要是来自于DNA复制错误，大约2/3癌症的发生被认为是由于DNA复制错误导致的（Tomasetti & Vogelstein (2015), Science, 347: 78-81; Tomasetti et al. (2017), Science, 355: 1330-1334），而DNA复制错误主要是来自于DNA复制叉的不稳定。DNA复制叉主要由两部分构成（图1）：Y字型的DNA结构和DNA复制体 (Replisome)。DNA复制体包含一系列与复制相关的蛋白质及蛋白质复合物，其中，最重要的是打开双链DNA模板的CMG（Cdc45-MCM-GINS）解旋酶复合物，以及进行新生链DNA合成的DNA聚合酶--DNA Pol α、δ、ε 。正常移动的DNA复制叉是相对稳定的，DNA复制体中的CMG解旋酶与DNA聚合酶在物理及生化功能上紧密偶联。但当DNA复制叉遭遇复制障碍停顿下来时，停顿的DNA复制叉被证明是不稳定的，倾向于垮塌。

上个世纪60年代末，在裂殖酵母里筛选到了一株突变株，命名为rad3-136。很快发现rad3-136突变株对羟基脲（Hydroxyurea (HU), 抑制dNTPs合成，导致DNA复制叉停顿）高度敏感。至此，细胞维持停顿DNA复制叉稳定的机制研究拉开了序幕。Rad3及相关蛋白介导的细胞调控，于1988年被命名为checkpoint调控（Weinert & Hartwell (1988), Science, 241: 317-322）,  Rad3被归类为ATR激酶。过去50年，前后上千个实验室，用两代人的时间，发表了上万篇研究文章，证明checkpoint是维持停顿DNA复制叉稳定的必需细胞调控。在checkpoint缺失或缺陷的细胞，停顿的DNA复制叉发生垮塌，导致DNA复制不能完成，及基因组的极度不稳定。但是，在试图阐明checkpoint调控维持DNA复制叉稳定的机制研究方面，碰到了极大阻力，阻力主要是来自于checkpoint调控的靶蛋白极难被确定，已发表文章的结论也互相矛盾，导致checkpoint调控维持DNA复制叉稳定的核心机制长期得不到确定。

图1 真核细胞DNA复制叉及S期细胞周期检验点（Leman AR, Noguchi E. The replication fork: understanding the eukaryotic replication machinery and the challenges to genome duplication. Genes. 2013 Mar;4(1):1-32.）。酵母Chk2在高等真核生物的功能同源蛋白是Chk1。

通过大规模的遗传筛选，孔道春实验室发现，复制解旋酶CMG（Cdc45-MCM-GINS）复合体的一个亚基Cdc45的突变能极大降低（600-3000倍）checkpoint 通路缺陷的细胞对HU的敏感性，暗示Cdc45或CMG复合体可能被checkpoint调控。然后，通过一系列遗传及生化分析，证明Rad3ATR-Cds1Chk2checkpoint通路直接调控DNA复制解旋酶CMG复合体。孔道春实验室发现：当DNA复制叉停顿后，Cds1Chk2同时磷酸化Cdc45亚基上的三个丝氨酸残基（且这三个Chk2/Chk1磷酸化位点在不同物种中相对保守）。这三个丝氨酸残基的磷酸化导致CMG复制解旋酶活性深度降低。CMG复制解旋酶活性的降低使得它不能脱离停顿复制叉，不能与被阻挡的DNA聚合酶分开。这样，停顿的DNA复制体（Replisome）及复制叉的生化完整性得到了维持，从而阻止了停顿DNA复制叉的垮塌。

为什么停顿复制叉里的复制解旋酶与DNA聚合酶会倾向于分开呢？这关联到两件事情：一是DNA复制体或DNA复制叉的基本生化特性；二是正常细胞生长过程中导致复制叉停顿的基本原因。DNA复制体中，DNA Pol ε负责合成前导链 （leading strand）合成,DNA Pol α和δ负责后随链（lagging strand）合成。由于后随链的合成稍微滞后于CMG解旋酶介导的DNA链解开，导致后随链的DNA模板上恒定的出现一段约200核苷酸长度的单链DNA区域。如果该单链DNA区域有形成DNA二级结构的序列，如G4、三股链、发夹结构等，DNA二级结构的形成就是一个大概率事件。形成的DNA二级结构会阻挡 DNA Pol α、δ的移动，导致复制叉停顿。在酵母细胞的染色体DNA上，大约有2000-4000个能形成DNA二级结构的序列。在人细胞中，能形成DNA二级结构的数目大约有数百万个（~75万个G4结构，及数倍于G4的三股链结构等）。因此，DNA二级结构导致的复制叉停顿是一个经常发生的生物事件。在前导链或后随链的DNA模板上, 如果有碱基损伤（每个人细胞每天有约105级别的这类损伤）或化学修饰，也会阻挡DNA Pol α、δ、ε（DNA聚合酶的活性中心非常精巧，只能容纳AT或GC配对，但不能容纳AC或GT配对，以保证DNA复制的精准性），导致复制叉停顿。当DNA聚合酶被阻挡后，CMG解旋酶还要往前移动，这样就会导致CMG解旋酶与DNA聚合酶物理上的分开，导致复制叉垮塌。

经过上千个实验室50年的不懈努力，checkpoint调控维持停顿DNA复制叉稳定的核心机制最终得到了阐明。即，1）停顿复制叉不稳定、倾向于垮塌的根本原因是：当DNA聚合酶被阻挡后，复制解旋酶与DNA聚合酶倾向于分开；2）checkpoint调控维持停顿复制叉稳定的核心机制是：降低复制解旋酶的活性，阻止复制解旋酶脱离复制叉 或DNA聚合酶，维持两者之间在物理及生化功能上的紧密偶联，从而维持停顿复制叉稳定，并保持它的生物学功能（图2）。孔道春实验室于2019年发现的chromsfork调控，通过提高停顿复制叉周围的染色质结构紧密程度，也是为了阻挡复制解旋酶脱离复制叉，以维持复制叉稳定(Feng et al. (2019), PNAS, 116(29):14563-14572)。

图2. Cds1Chk2磷酸化复制解旋酶CMG里的Cdc45亚基，深度降低复制解旋酶活性，阻止复制解旋酶与DNA聚合酶分开，从而稳定停顿复制叉。

孔道春教授为该论文的通讯作者。刘阳博士和王露（2015级博士研究生）为该论文的共同第一作者。许鑫、袁越、张波、李泽阳、谢雨晨、闫睿、郑泽琦、北京大学生命科学学院纪建国教授、英国Sussex大学的Johanne M. Murray和Antony M. Carr教授也对本研究作出重要贡献。感谢实验室所有成员的帮助。本工作得到了北大-清华生命科学联合中心、科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金委、蛋白质与植物基因研究国家重点实验室以及生命科学学院仪器中心（成像平台及流式平台）的大力支持，在此，表示衷心感谢。