王忆平研究团队与合作者成功创制2.0版多聚蛋白型固氮酶系统，为实现真核系统自主固氮迈进坚实的一步

将固氮酶系统导入植物细胞以实现农作物自主固氮，从而减少或替代工业氮肥在农业生产中的应用是生物固氮研究的终极目标。2023年8月16日，北京大学蛋白质与植物基因研究国家重点实验室王忆平研究团队与北京大学现代农学院杨建国研究员在美国科学院院刊《PNAS》上以Article的形式在线发表了题为“Organelle-dependent polyprotein designs enable stoichiometric expression of nitrogen fixation components targeted to mitochondria”的研究论文，创制了基于线粒体信号肽酶的多聚蛋白型固氮酶系统，进一步解决了真核细胞中协调表达固氮酶组分时面临的瓶颈问题。

固氮酶系统高度复杂，需要十几个甚至几十个基因同时且按特定比例表达才能实现其功能性，以上特性极大的限制了固氮酶系统向真核细胞的转移。为了解决多基因协调表达的问题，2018年本研究团队借鉴了植物病毒多聚蛋白的策略，利用烟草蚀刻病毒的TEVp蛋白酶，在大肠杆菌底盘中成功将产酸克雷伯菌的钼铁固氮酶系统转化为了仅含有5个巨大基因的多聚蛋白型固氮酶系统（Yanget al., 2018PNAS）。

然而，将该系统引入酵母细胞底盘时，发现并不能成功的表达固氮酶的各个组分，通过分析发现外源蛋白酶TEVp与固氮酶组分共表达时可能对酵母细胞产生了潜在的细胞毒性。为了解决这一新的问题，本研究中选择了真核细胞中内源且高度保守的线粒体信号肽酶MPP用来替代外源蛋白酶TEVp在上述多聚蛋白型固氮酶系统的切割作用，通过设计和筛选获得了一组可以被MPP高效识别与切割且仅包含10个氨基酸残基信号肽序列，并基于该序列以及酵母线粒体内源MPP构建了2.0版本的多聚蛋白型钼铁固氮酶系统，从而成功规避了上述细胞毒性风险，实现了固氮酶组分在酵母线粒体中的高效、协调表达，这一研究为实现真核系统自主固氮迈进坚实的一步。

在简化固氮酶系统以利于其在真核系统表达这一重要研究方向上，这是本研究团队在PNAS发表的第5篇系列研究论文，杨建国研究员与2017级博士研究生相楠（该生已于2022年夏毕业并获得博士学位）为论文共同第一作者；英国JIC研究中心Ray Dixon教授、北京大学杨建国研究员、王忆平教授为论文共同通讯作者；博士生刘逸珩、郭琛月、李晨昱、蔡舒怡以及博士后李辉参与了部分研究工作。本研究得到了科技部国家重点研发计划《合成生物学专项》、国家自然科学基金国际合作重点项目、北京大学生科启东创新基金、蛋白质与植物基因研究国家重点实验室的资助。

附图：线粒体中多聚蛋白型固氮酶系统示意图

参考文献：

1. Jianguo Yang#, Xiaqing Xie#, Nan Xiang, Zhe-Xian Tian, Ray Dixon*, and Yi-Ping Wang*. (2018) Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. PNAS. 115 (36): E8509-E8517

2. Jianguo Yang#,*, Nan Xiang#, Yiheng Liu, Chenyue Guo, Chenyu Li, Hui Li, Shuyi Cai, Ray Dixon*, Yi-Ping Wang*. (2023)Organelle-dependent polyprotein designs enable stoichiometric expression of nitrogen fixation components targeted to mitochondria. PNAS. 120 (33): e2305142120

原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2305142120